产品货号：
BTN15-15930
中文名称：
甲型流感病毒H3亚型qRT-PCR试剂盒(探针法)
英文名称：
Influenza Virus A H3 Probe qRT-PCR Kit
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是百奥莱博公司以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的，专门用于甲型流感病毒H3亚型研究检测的试剂盒。
甲型流感病毒(Influenza Virus A)，也称禽流感病毒，是一种常见负链RNA流感病毒，其病毒颗粒包含了8段不同的RNA基因。在病毒颗粒的表面，存在两种最为主要的蛋白质，即血凝素(Hemagglutinin，H)和神经氨酸酶(Neuraminidase，N)，它们决定了病毒的亚型。其中，甲型流感病毒H3亚型主要在人群中广泛传播。甲型流感病毒H3亚型的H蛋白质允许病毒侵入宿主细胞，而N蛋白质则有助于病毒释放出宿主细胞。这两种蛋白质也是流感病毒的主要抗原，它们决定了病毒的免疫原性和毒力。甲型流感病毒H3亚型感染人类会引发禽流感，该病症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。因此快速灵敏诊断甲型流感病毒H3亚型具有重要意义。
- 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
- 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/μL。
- 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
- 特异性高，引物是根据甲型流感病毒H3亚型RNA高度保守区设计，不会跟其他的RNA发生交叉反应。
- 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
- 本制品只能用于科研。
| 组分 | 规格 |
| 探针法RT-PCR缓冲液 | 500μL |
| 探针法RT-PCR酶混合液v2 | 50μL |
| 荧光PCR模板专用稀释液 | 1mL |
| 超纯水 | 1mL |
| 甲型流感病毒H3亚型qRT-PCR引物-探针干粉 | 50T |
| 甲型流感病毒H3亚型qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期一年。
甲型流感病毒H3亚型qRT-PCR引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
一、稀释标准曲线样品
以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本制品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
- 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
- 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
- 在6号管中加入5μL1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在5号管中加入5μL1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在4号管中加入5μL1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 重复上面的操作直到得到6稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
- 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是样品制备PC(样品制备阳性对照)，一个是样品制备NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备PC。另外用水作为样品制备NC。
- 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
三、设置qRT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
- 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，5个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用试剂盒提供的阳性对照的10000倍稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
- 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
成分 样品管
N+2个PCR阴性
对照管标准曲线样品管
(1～6管)探针法qRT-PCR缓冲液 10μL 10μL 各10μL 探针法qRT-PCR酶混合液v2 2μL 2μL 各2μL 甲型流感病毒H3亚型探针法qRT-PCR引物-探针混合液 3μL 3μL 各3μL N+2个待测RNA模板 5μL 不加 不加 超纯水 不加 5μL 不加 第6步所得标准曲线样品稀释液(2～6号) 不加 不加 各5μL - 盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程 温度 时间 逆转录 50℃ 15min 预变性 95℃ 5min PCR反应
(40个循环)95℃ 15sec 60℃ 60sec(采集FAM通道的荧光信号，
淬灭基团为BHQ1)
四、数据处理
- 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
- 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于35，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于35，则为阴性。如果Ct小于35则为阳性。
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